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骨髓間充質干細胞采集、分離純化與保存
時間:2019-11-04 11:43:47  作者:微微  來源:《微創美容外科學》
采集:用18號穿刺針穿刺,20ml注射器(內含肝素2000u)在髂前上棘抽取骨髓10ml。抽取骨髓時注意保持針頭斜面在骨髓內。迅速抽取骨髓并使其和肝素均勻,防止產生血凝塊。
  1、采集:用18號穿刺針穿刺,20ml注射器(內含肝素2000u)在髂前上棘抽取骨髓10ml。抽取骨髓時注意保持針頭斜面在骨髓內。迅速抽取骨髓并使其和肝素均勻,防止產生血凝塊。
  2、分離純化:經1200rpm離心10min,吸除上層脂肪組織,洗滌三次。在骨髓中注入密度為1.073Percoll分離液。室溫下3000g離心30min,有核細胞在分界面及上層液體中,紅細胞大部分在沉淀中。用兩倍體積的PBS稀釋,并再次離心。將細胞重懸于低糖10%DMEM+FBS培養液中。調整細胞密度為1.6*106個/cm2接種于培養瓶中。37℃,體積分數為5%的CO2恒溫培養箱中培養,72d后棄去未貼壁細胞,以后每3天換液一次。當細胞匯合90%單層細胞后,0.25%胰蛋白酶室溫消化傳代,離心(1000rpm,10min),棄上清,沉淀按1:1比例傳代。
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  3、保存:收集生長良好的細胞,取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數細胞濃度及凍前存活率。將細胞加入到含10%DMSO和30%血清的新鮮培養基中,用無菌塑料冷凍保存管放入到程序降溫盒中,于-70℃經24h后轉入液氮保存。30d后,復蘇細胞,用椎蟲藍染色檢測細胞活性,于37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養,每日倒置光學顯微鏡下觀察細胞生長情況(細胞生長狀態及數量)。主要觀察指標:1)人骨髓間充質干細胞的生長曲線分析;2)細胞冷凍機復蘇生長特性分析。
關鍵字:間充質干細胞
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